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DNA人工合成原理
2017-10-26
基因的基本单位为核苷酸,每个核苷酸包含三种成分:碱基、戊糖和磷酸。DNA的单体单位为脱氧核苷酸,其中戊糖是D-2-脱氧核糖。四种碱基分别为腺嘌呤(A) 、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。
      在核苷酸中两类杂环化合物嘧啶和嘧呤具有很明显的芳香族特性。嘌呤本身可以认为是嘧啶的1种衍生物,它是1个嘧啶环和咪唑环耦合在一起组成的。在大多数细胞中,碱基只有少数呈游离或不结合形式存在,而且它们通常是酶水解核苷酸的产物。游离嘧啶和嘌呤碱基在水中是相对难溶解的,是弱碱性化合物,随pH不同能以两种或多种互变异构的形式存在。嘧呤碱基的第九氮原子或嘧啶碱基的第一氮原子与戊糖的第一碳原子形成β-N糖苷酸通称核苷。核苷按所含糖的不同分为:D-核糖核苷类和2-脱氧-D-核糖核苷类。在大多数细胞中只有微量的游离核苷存在。核苷比相应的碱基易溶于水,在不同pH条件下存在与碱基类似的互变异构,N-糖苷键对酸不稳定。核苷的磷酸酯称核苷酸。核糖有3个游离羟基,所以核糖核苷酸有 2′、3′和5′核苷酸。脱氧核糖只有2个羟基可以酯化,故脱氧核糖核苷酸只有3′和5′核苷酸。核酸分子是由核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接而成。
      DNA的化学合成研究始于50年代。1952年阐明核酸大分子是由许多核苷酸通过3′-5′磷酸二酯链键连接起来的这个基本结构以后,化学家们便立即开始尝试核酸的人工合成。英国剑桥大学Todd实验室于1958年首先合成了具有3′→5′磷酸二酯键结构的TpT和pTpT,此后,Khorana等人对基因的人工合成作出了划时代的贡献,不仅创建了习近平的磷酸二酯法,而且发展了一系列有关核苷酸的糖上羟基、碱基的氨基和磷酸基的保护基及缩合剂和合成产物的分离、纯化方法。到目前为此,使用的DNA合成方法有磷酸三酯法、亚磷酸酯法及亚磷酸酰胺法。此后又发展了固相化技 术,实现了DNA合成的自动化。
     由于合成技术的迅速发展,具有特定顺序的核酸合成取得了丰硕的成果。1972年Khorana 等人合成了相当于酵母内丙氨酸tRNA结构基因的DNA双链,1979年完成了包括启动和调节顺序在内的共有207个碱基对的大肠杆菌酪氨酸校正tRNA 基因。一系列蛋白和多基因,如胰岛素、生长激素、α-和β-干扰素、胸腺素和脑啡肽等相继合成并得到表达。我国科学工作者于1981年完成了酵母丙氨酸 tRNA的全合成,这是世界上第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。DNA的人工合成正在分子生物学和医学等许多领域中发挥越来越多的作用。
      DNA合成的含义是将核苷酸单体按3′、5′磷酸二酯键连接,使其具有天然的DNA分子的全部生物学活性和特定的排列顺序。由于核苷酸是一个多官能团的化合物,在连接反应中除了特定的基团会发生反应外,其它如核糖和磷酸羟基、碱基上的氨基等基团也会参加反应产生错接等,从而真正需要的产物的产率降低并且影响产物的分离纯化。因此,在DNA的化学合成中总是将暂时不需要的基团保护起来,并且在下一轮缩合反应之前将这些保护基有选择地除去,这样不断迅速形成专一的3′→5′磷酸二酯键的特定核酸苷排列。
      固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分DNA自动合成仪所使用的方法,合成的原理及步骤:首先将欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1) 以其3′OH通过1个长的烷基臂与固相载体(不溶性的高分子物质,常用的有硅胶S、交联的聚苯乙烯、特殊孔径的多孔玻璃珠等)耦联、N1的5′OH以二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护。然后从N1开始逐步地接长寡核苷酸酸链。1个合成循环包括4步。第一步为去保护(deprotection)以苯磺酸(或三氯醋酸)处理带有保护基的核苷,去除5′末端的DMTr,暴露出5′OH,经洗涤后进行下步反应。第二步为耦联反应(coupling) ;加入经四唑作用(激活)的核苷N2,使之与核苷N1上的5′OH起耦联反应,乙腈洗涤。第三步为加帽反应(capping);加入醋酐及二甲基氨基吡啶,使未参加反应的寡核苷酸链(2%以下)乙酰下,乙酰化的链不参加下一步反应,如此有利于纯化所需全长的DNA片段。第四步为氧化反应 (oxidation);加入经四唑作用(激活)的核苷N2,使之与核苷N1上的5′OH起耦联反应,乙腈洗涤。第三步为加帽反应(capping);加入醋酐及二甲基氨基吡啶,使未参加反应的寡核苷酸链(2%以下)乙酰化,乙酰化的链不参加下一步反应,如此有利于纯化所需全长的DNA片段。第四步为氧化反应(oxidation),加入碘,使三价的亚磷酸转变为更稳定的五价磷酸。上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历一轮循环,接长1个核苷酸。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上,过量的未反应物或分解物则通过过滤或洗涤除去。当整个链达到预定的长度后,从固相载体上切下,脱去保护基(氨解),并经过分离纯化得到所需要析最后产物。
 
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